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Annexin V-Cy5 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

簡要描述：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和一些疾病發(fā)生過程等方面起著十分重要的作用。在正常細(xì)胞中，磷脂酰（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。在體內(nèi)，巨噬細(xì)胞可以識別翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面的PS 從而將這些程序性死亡的細(xì)胞清除，因此凋亡過程中并不伴隨局部的炎癥反應(yīng)，而在細(xì)胞壞死的過程中則常常伴隨著炎癥反應(yīng)。

  • 產(chǎn)品型號：
  • 廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家
  • 更新時間：2024-11-11
  • 訪  問  量：177

詳細(xì)介紹

保存溫度                        
2-8℃避光
Annexin V-Cy5 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒注意事項                        
1.長期不用可以-20℃保存。
2.Annexin V-Cy5染色液避免反復(fù)凍融。多次凍融會導(dǎo)致失效。
3.Annexin V-Cy5染色液需要長期保存時可以根據(jù)使用情況進(jìn)行小量分裝后-20℃保存。
4.試劑拆封后請盡快使用完！
有效期                        
1年
1.檢測方法
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡
                       
適用樣本                        
1.懸浮細(xì)胞
2.貼壁細(xì)胞
產(chǎn)品特點                        
1.方便：可用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測；
2.快速：1小時內(nèi)即可完成實驗；
3.準(zhǔn)確：能準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，并計數(shù)各群細(xì)胞的比例。
                       
產(chǎn)品應(yīng)用                        
1.流式細(xì)胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡
                       
儀器準(zhǔn)備                        
1.流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦
2.離心機
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
                       
試劑準(zhǔn)備                        
1.PBS 緩沖液（pH7.4，實驗室常用的10mM磷酸緩沖鹽溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
耗材準(zhǔn)備                        
1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套
4.鋁箔
                       
Annexin V-Cy5 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒使用注意事項                        
1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體損失導(dǎo)致試劑量不夠用。
2.細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。離心力在不損失細(xì)胞的前提下盡可能小，重懸細(xì)胞是動作要輕柔，避免多次反復(fù)的激烈吹打。不用渦旋振蕩器。
3.Annexin V-FITC（等）和Propidium iodide（等）是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光，盡量減少它們暴露在光下的時間。有必要時可以使用帶蓋子的冰盒或鋁箔紙避光。標(biāo)記后將細(xì)胞保持在避光環(huán)境中。移液過程中短暫暴露在光線下（<30秒）是可以接受的。
4.由于細(xì)胞凋亡是一個快速和動態(tài)的過程，因此在染色后立即進(jìn)行分析。
5.使用Annexin V-FITC（等） 試劑盒檢測凋亡需要針對活細(xì)胞。不要固定細(xì)胞，固定操作會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。
使用方法                        
樣品染色：
1. 離心收集懸浮細(xì)胞。離心機300-500g力，2-8°C，離心時間5分鐘，棄培養(yǎng)基。（貼壁細(xì)胞用不含EDTA的消化后離心，收集細(xì)胞。消化時間不宜過長，以防損傷細(xì)胞膜，引起假陽性）。
2. 用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。
3. 用400ul 1X Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，濃度大約為1 X 106 cells/ml。
4. 在細(xì)胞懸浮液中加入5ul Annexin V- Cy5染色液，輕輕混勻后于2-8°C避光條件下孵育15分鐘。
5. 加入其它顏色的核酸染色液后輕輕混勻于2-8°C避光條件下孵育5分鐘。
6. 立即用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測。

流式細(xì)胞儀分析：
上機檢測前，須用待測細(xì)胞制備三個質(zhì)控樣本來設(shè)定流式細(xì)胞儀的熒光補償和設(shè)置十字門的范圍：
① 空白管，沒有染色的細(xì)胞：不加Annexin V- Cy5。用于調(diào)節(jié)電壓。
② 單染管，Annexin V- Cy5單染細(xì)胞：用明顯凋亡的細(xì)胞，僅用Annexin V- Cy5染色細(xì)胞。用于調(diào)節(jié)補償。
③ 單染管，7-AAD/PI/其它單染細(xì)胞：僅用核酸染料染色細(xì)胞。用于調(diào)節(jié)補償。
④ 檢測管：待測的處理細(xì)胞，加Annexin V- Cy5，加核酸染料。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
【注】：
具體流式設(shè)置按常規(guī)方法即可。請參照流式細(xì)胞儀說明書或咨詢儀器技術(shù)支持。
經(jīng)處理過的細(xì)胞此時可以在流式細(xì)胞儀上分析。
按照常規(guī)的流式凋亡檢測的操作即可。
Annexin V-Cy5的熒光激發(fā)波長652nm，發(fā)射波長670nm；
     
熒光顯微鏡/激光共聚焦觀察：
1. 滴加30-50ul用Annexin V-Cy5染色的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞。
注：對于貼壁細(xì)胞，可以象懸浮細(xì)胞那樣染色后， 滴一滴細(xì)胞懸液于載玻片上，用蓋玻片蓋上細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察。也可直接用蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。根據(jù)蓋玻片大小，置于24孔或12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，然后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞染色在細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行。先用PBS沖洗兩次，加入400μl Annexin V結(jié)合液于孔中。再加入5μl Annexin V-Cy5染色液，混勻。避光室溫反應(yīng)10分鐘。
2. 在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。

Annexin V-Cy5染色陽性的細(xì)胞將在細(xì)胞膜表面呈現(xiàn)明亮的紅色。其它非滲透核酸染料在早期凋亡細(xì)胞不會被染色或顯示背景熒光，而壞死或晚期凋亡細(xì)胞則會顯示顏色，相應(yīng)顏色的胞核和環(huán)繞細(xì)胞的紅色胞膜。在晚期凋亡細(xì)胞中還可以觀察到胞膜皺縮和起泡。

                      

常見問題分析                        
實驗過程中Annexin V染不上色或陽性率偏低?？赡艿脑蛉缦拢?br/>1. 用于檢測的流式細(xì)胞儀/顯微鏡設(shè)置不當(dāng)。調(diào)整使用正確的儀器設(shè)置。
2. 確定實驗中的誘導(dǎo)劑是否能產(chǎn)生凋亡。可通過設(shè)定確切凋亡誘導(dǎo)效果的陽性藥物對照來排除這一情況。
3. 細(xì)胞未啟動凋亡。重新確定誘導(dǎo)后凋亡啟動的時間點（時程實驗）。
4. 細(xì)胞數(shù)量偏少。增加細(xì)胞數(shù)量。
5. 貼壁細(xì)胞消化不當(dāng)。Annexin V 跟PS 的結(jié)合需要Ca2+離子，結(jié)合液中含有Ca2+，EDTA 的消化會影響染色，建議使用無EDTA 的，或者消化后用PBS洗滌干凈。

實驗過程中陽性率偏高?？赡艿脑蛉缦拢?br/>1. 用于檢測的流式細(xì)胞儀/顯微鏡設(shè)置不當(dāng)。調(diào)整使用正確的儀器設(shè)置。
2. 細(xì)胞本身活力太差。實驗中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡的對照細(xì)胞經(jīng)染色后AnnexinV+/PI+雙陽性的細(xì)胞比例過高，造成這種結(jié)果的原因可能是細(xì)胞本身活力太差。建議用臺盼藍(lán)染色計算細(xì)胞的活力，臺盼藍(lán)拒染的細(xì)胞應(yīng)大于95%。若活力偏低低，建議重新復(fù)蘇細(xì)胞，通常剛復(fù)蘇的細(xì)胞至少要傳代3 次以后才能進(jìn)行實驗。
                       
參考文獻(xiàn)                        
1.Wei Bing, Hanjun Sun et al.
Programmed Bacteria Death Induced by Carbon Dots with Different Surface Charge
Small         2016      （IF=8.315）

2.Linchong Sun, Libing Song et al.
cMyc-mediated activation of serine biosynthesis pathway is critical for cancer progression under nutrient deprivation conditions
Cell Research     2015       （IF=14.812）

3. Jian Chen, Weijie Zhang et al.
Mn(II) mediated degradation of artemisinin based on Fe3O4@MnSiO3-FA nanospheres for cancer therapy in vivo
Nanoscale      2015       （IF=7.76）

4. Yuanxin Zhang, Zhiyao Hou et al.
DNA-Hybrid-Gated Photothermal Mesoporous Silica Nanoparticles for NIR-Responsive and Aptamer-Targeted Drug Delivery
ACS Appl. Mater. Interfaces     2015       （IF=7.145）

                       


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