探針染色工作液配制：
根據(jù)樣本數(shù)量，用HBSS將BBoxiProbe® O06熒光染料1000-2000倍稀釋，配制成探針染色工作液。

探針標(biāo)記
原位標(biāo)記：僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。
1、 培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿準(zhǔn)備細(xì)胞樣本。
2、 待細(xì)胞生長(zhǎng)到合適豐度，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗細(xì)胞一次。
3、 加入適量體積37℃預(yù)熱的含O06探針工作液。
4、 在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)于生長(zhǎng)狀態(tài)下避光孵育20分鐘～40分鐘（具體孵育時(shí)間需根據(jù)細(xì)胞類型而定，需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化）。
5、 移除染色液，用PBS（pH7.4）洗滌細(xì)胞3次。以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的O06探針。
6、 加入200 μL HBSS緩沖液。
7、 熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡（含合適濾片）檢測(cè)。最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488 nm / 516 nm。

收集后標(biāo)記：懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞消化處理
1. 離心，吸除上清培養(yǎng)基。
2. 用PBS洗細(xì)胞一次。
3. 細(xì)胞收集后重懸浮于稀釋好的37℃預(yù)熱的O06探針工作液中，細(xì)胞濃度為1*106-2*107/毫升。
4. 于生長(zhǎng)狀態(tài)下37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20-30分鐘（具體時(shí)間需根據(jù)細(xì)胞類型而定，需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化）。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。
5. 離心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重懸細(xì)胞，洗滌3次。以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的O06探針。
6. 用HBSS/PBS/無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
7. 用熒光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488 nm / 516 nm。

活性氧檢測(cè)：
1. 對(duì)于原位標(biāo)記探針的樣品可以用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，或者用激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡，直接拍照分析（需要有相關(guān)的熒光強(qiáng)度分析軟件）。
2. 或收集細(xì)胞后標(biāo)記探針然后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
3. 對(duì)于收集細(xì)胞后標(biāo)記探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用激光共聚焦顯微鏡直接拍照分析也可以（需要有相關(guān)的熒光強(qiáng)度分析軟件）。
4. 使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，520 nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。
探針O06的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)。
5. 熒光強(qiáng)度強(qiáng)，活性氧含量高。